本文主要覆盖了肿瘤样本bulk RNA-seq数据常见的分析步骤，并从实践角度出发，较为具体地介绍了每一步骤依赖的工具和数据集。
另外，尽管本文适用于肿瘤样本，但其中的一些步骤，如基础分析、差异表达等是普适的，并不局限于肿瘤样本。

基础分析

1. 质控（reads）

• base call: 通常使用Q分数 (Phred quality score)衡量测序平台的准确性。fastqc,
• adaptors: Cutadapt,
• species/vector/ribosomal contamination:
• library complexity:
• mapping rates: RSeQC > bam_stat.py
• library stranded or not: RSeQC > infer_experiment.py,

推荐工具：fastp, RseqQC

Q分数 表示特定碱基被测序仪测错的概率。

2. 比对

推荐工具：STAR

首先，准备比对所需的基因组索引文件。索引文件获取方式以下两种：①使用STAR生成，该操作依赖基因组序列和基因组注释两个数据集，推荐从Gencode网站下载。②从网络下载别人已经建好的索引文件（不推荐）。
如已有基因组索引文件，请跳过该步骤。

# 生成基因组索引
STAR \
  --runMode genomeGenerate \                           #运行index生成任务
  --genomeDir /path/to/genomeDir \                     #存储index路径
  --genomeFastaFiles /path/to/genome/fasta1 ... \  #基因组参考序列文件
  --sjdbGTFfile /path/to/annotations.gtf \         #转录本注释文件
  --runThreadN 8 \                                     #指定使用线程数
  --sjdbOverhang 150                                   #指定剪接点侧翼序列长度

然后，将样本测序数据比对到参考基因组。

STAR
  --genomeDir /path/to/genomeDir \      #存储index路径
  --readFilesIn /path/to/read1 ... \    #待比对序列文件，FASTQ或FASTA格式。支持多样本输入。
    --readFilesCommand zcat \             #解压序列文件的明令
  --outFileNamePrefix .                 #输出前缀
  --sjdb*    #version > 2.4.1a
  --outFilterType BySJout                #
  --outFilterMultimapNmax 20             #
  --outReadsUnmapped None
  --alignSJoverhangMin 8                 #
  --alignSJDBoverhangMin 1               #
  --outFilterMismatchNmax 999            #最大错配数
  --outFilterMismatchNoverReadLmax 0.04  #最大错配比例
  --outSAMstrandField intronMotif
  --outSAMunmapped Within 
  --outSAMheaderHD @HD VN:1.4
  --outSAMtype BAM Unsorted
  --alignIntronMin 20                    #内含子最小长度
  --alignIntronMax 1000000               #内含子最大长度
  --alignMatesGapMax 1000000             #mates间最大距离
  --alignSJDBoverhangMin 10
  --alignSJstitchMismatchNmax 5 -1 5 5
  --runThreadN 8 \    #使用线程数
  --chimSegmentMin 12 \
  --chimJunctionOverhangMin 12 \
  --chimNonchimScoreDropMin 10
  --chimOutJunctionFormat 1 \
  --peOverlapNbasesMin 12
  --peOverlapMMp 0.1 
  --genomeLoad NoSharedMemory 
  --quantMode TranscriptomeSAM

STAR manual

3. 质控（alignment）

推荐工具：RseQC是用于检查比对质量的常见工具，包括多个质量评估脚本，用户可以按需使用。

首先，为了减少运行时间，可以从BAM中选取部分比对进行质量评估。

# 1) 从比对采样50%
samtools view -s 0.5 -b sample.sorted.bam  > sample_p50.bam 
# 2) 选择管家基因的比对
bedtools intersect -a sample_p50.bam -b hk.bed > sample_p50_hk.bam 
# 3) 建索引
samtools index sample_p50_hk.bam  > sample_p50_hk.bam.bai

然后，使用RseQC中相应的脚本评估质量。每个脚本依赖的数据集分别在对应命令下方列出。

bam_stat.py -i sample_p50_hk.bam    #比对统计
geneBody_coverage.py -i sample_p50_hk.bam -r refGene.bed    #reads在gene body覆盖分布
  #1) 下载：https://sourceforge.net/projects/rseqc/files/BED/
read_distribution.py  -i sample_p50_hk.bam -r refGene.bed    #reads在基因组不同区域覆盖分布

RseQC质量指标：

• Transcript integrity number (TIN)：整个基因组中具有均匀reads覆盖的转录本的百分比，用于衡量RNA完整性。RseQC会计算每个转录本的TIN，并报告样本中所有转录本TIN的平均数、中位数和标准差，中位数（medTIN）常用来表示每个样本的 RNA 完整性。
• Gene body coverage：显示了reads在基因体上的覆盖度。
• Read distribution：总结了比对到不同基因组区域（如外显子和内含子）的reads比例。

低质量样本的比对率低、完整性低或reads分布异常，应在下游分析中剔除。

4. 定量

定量主要包括计数和标准化两个步骤。标准化是从计数结果中去除测序深度、基因长度等非表达因素的影响，具体方法包括FPKM，TPM等。

下表总结了一些常见的用于定量的工具。

	input	level	output
featureCount	bam	基因	counts
RSEM	。	基因；转录本	TPM, [RF]PKM,
Salmon	。	转录本	TPM

# 使用gtftools
HSA_GTF=Homo_sapiens.GRCh38.90.gtf
grep -v '#' $HSA_GTF | awk '$1=1' OFS='\t' > $HSA_GTF.tmp
gtftools.py  -l Homo_sapiens.GRCh38.90.gtf.genelength  Homo_sapiens.GRCh38.90.gtf.tmp

#
#gawk '$3~/exon/ && match($0, /gene_id "(.*)"; transcript_id "([^"]+)";/, a) {print $1,$4,$5,a[1],a[2]}' OFS='\t' $HSA_GTF |sort -k1,1V -k2,2n |bedtools merge -i - > tmp

Using GTF tools to get gene lengths
GTFtools

5. 样本合并

下游分析的输入一般需要将每个样本的分析结果合并，这通过简单脚本就可以方便的实现。

差异表达

1. 质控（cohort）

2. 差异分析

推荐工具：Deseq2, EdgeR, wilconxon rank-sum,

转录丰度文件，read计数矩阵，htseq-count文件，SummarizedExperiment对象都可以作为DESeq2 的输入文件。

# 示例1：Salmon输出 & tximport（用于将Salmon/Sailfish/kallisto/RSEM输出转换为转录丰度文件）
library("tximport")
library("readr")
library("tximportData")
library("DESeq2")

# 加载样本信息表
dir <- system.file("extdata", package="tximportData")
samples <- read.table(file.path(dir,"samples.txt"), header=TRUE)
samples$condition <- factor(rep(c("A","B"),each=3))    #该列存储分组信息
    #sample$condition <- relevel(sample$condition, ref="B")    #设置B为比较的基线/野生型
rownames(samples) <- samples$run
#samples[,c("pop","center","run","condition")]

# 加载salmon结果
files <- file.path(dir,"salmon", samples$run, "quant.sf.gz")
names(files) <- samples$run
tx2gene <- read_csv(file.path(dir, "tx2gene.gencode.v27.csv"))

# 将salmon结果转换成Deseq2能用的转录丰度文件
txi <- tximport(files, type="salmon", tx2gene=tx2gene)

# 用txi对象和样本信息构建DESeqDataSet对象
ddsTxi <- DESeqDataSetFromTximport(txi,
                    colData = samples,
                    design = ~ condition)    #校正批次效应：design = ~ batch + condition，其中batch为样本信息表中记录批次信息的列名

dds <- DESeq(ddsTxi)    #等效以下三步
    #ddsTxi <- estimateSizeFactors(ddsTxi)    # 测序深度归一化
    #ddsTxi <- estimateDispersions(ddsTxi)    # 基因离散度估计
    #ddsTxi <- nbinomWaldTest(ddsTxi)    #  # 负二项GLM拟合 & Wald检验

DESeq2输出值包括：

• baseMean：所有样本标准化后计数的均值；
• log2FoldChange：分组间倍数变化的log2转换值；
• lfcSE：log2FoldChange的标准误；
• stat：Wald统计量；
• pvalue：对Log2FoldChange估计的Wald检验的p值
• padj：FDR调整p值（BH方法）

Deseq2 vignette

3. 可视化（差异）

火山图的x轴代表log2FC，上调基因的log2FC为正，下调基因的log2FC为负。y轴代表 -log10(pvalue)。

富集分析

基因集富集分析（GSEA）可以检测预定义基因集（如DEG等）是否影响了特定通路、分子功能、细胞组分或过程。

推荐工具：clusterProfile
常见基因集：KEGG canonical pathways, GO(BP/CC/MF), MSigDB Hallmark gene sets, …

library(clusterProfiler)
library(enrichplot)
library(ggplot2)
library(org.Hs.eg.db)

Gene Set Enrichment Analysis with ClusterProfiler

肿瘤免疫

1. 免疫组库

当肿瘤被T/B细胞浸润，如果其受体T/BCR能识别和结合肿瘤相关抗原，T/B细胞就会被激活。T/BCR具有高度多样性，以允许不同的T/B细胞识别不同的病原体或肿瘤相关抗原。T/BCR的多样性部分是由于V(D)J重组。
CDR3是T/BCR的一个高度可变区，是这些受体抗原结合部位的核心。免疫组库（描述肿瘤样本中 TCR/BCR的CDR3序列）对于量化T/B细胞多样性和克隆性至关重要。这些指标是重要的肿瘤免疫特征和免疫疗法反应的关键指标。

推荐工具：TRUST4

V(D)J重组会产生与参考基因组不一致的序列。TRUST使用比对到参考基因组V/D/J区域的reads和无法比对到参考基因组的reads，推断从头组装的CDR3序列。

./run-trust4 \
    -b example.bam \
    -f hg38_bcrtcr.fa \    #包含V/D/J/C基因序列和坐标的fa文件
    --ref human_IMGT+C.fa    #来源于IMGT数据库的V/D/J/C基因参考fa文件

…

2. 免疫浸润

3. 免疫响应

4. 新抗原预测

肿瘤突变会导致蛋白质发生改变，这些蛋白质可能成为新抗原，并可能引起免疫反应。

适应性免疫依赖细胞表面呈现的peptide-MHC。人类 MHC 有两大类，即 I 类和 II 类（分别由 HLA-I 和 HLA-II 等位基因编码）参与抗原呈递。MHC I 类蛋白复合物在所有正常细胞上表达，呈递内部降解的蛋白质，而 MHC II 类蛋白复合物通常在APC上表达，呈递经过处理的外部抗原。MHC I 类蛋白复合物的抗原结合部分由 HLA-I 基因 HLA-A、HLA-B 和 HLA-C 编码。MHC II 类蛋白质的抗原结合部分由 HLA 复合物 DP、DQ 和 DR 区域中的 α 和 β 基因编码，包括 HLA-DQA1、HLA-DQB1 和 HLA-DRB1。目前基于比对的HLA分型方法需要输入 DNA 或 RNA 测序，只能预测 HLA-I 类或 HLA-II 两类。例如，arcasHLA、HLAProfiler和seq2HLA就是通过RNA-seq数据进行高分辨率HLA分型。OptiType 和 PHLAT 是用于RNA、WES和WGS数据的HLA鉴定工具。HLA 参考序列可从 ImMunoGeneTics (IMGT) 数据库中获取。

新抗原预测算法通常使用NetMHCpan、MHCflurry和SMMalign等工具整合肽/MHC 结合预测。

# 使用arcasHLA对RNA-seq数据进行HLA-I/II分型
## 提取reads
arcasHLA extract \
  ${sample}.sorted.bam \
  -t 16 \
  --sample $sample \
  -o $out_np_dir
## 使用提取reads进行分型
arcasHLA genotype \
  ${sample}.extracted.1.fq.gz \
  ${sample}.extracted.2.fq.gz \
  -g A,B,C,DQA1,DQB1,DRB1 \
  -t 16 \
  -o $out_np_dir

使用体细胞突变和 HLA 等位基因信息鉴定新抗原。体细胞突变检测的标准方法是分析肿瘤与配对正常组织的WES/WGS数据，常见的突变检测工具包括MuTect, Varscan2等。其中Varscan2可以应用于具有良好覆盖率的 RNA-seq 数据，不过预计突变检测仍会比 DNA 测序产生的突变检测噪音大。之后，VEP可用于注释基因、转录本和调控区的变异。

微生物组

在不同癌种中，肿瘤内微生物群的组成和丰度具有高度异质性。借助高通量测序技术，能够探索肿瘤宿主和宿主体内各种微生物的基因组，进而通过分析其与疾病表型、治疗效果等关系，阐明疾病发展的新机制，为发现治疗目标提供新见解。
一般使用16S rRNA和鸟枪法测序完成微生物系统发育和分类。研究人员还开发了使用基于参考基因组的高通量测序方法，如PathSeq和Centrifuge。PathSeq利用 BWA-MEM 将非宿主reads与预先定义的微生物序列进行比对，而Centrifuge则先建立基因组序列的压缩索引。虽然两者都能实现对微生物群的分类和丰度估计，但在内存使用和速度方面，Centrifuge优于PathSeq。
Centrifuge使用FM-index来存储数据库中的所有序列信息。Centrifuge会在reads和参考数据库之间贪婪寻找长匹配序列，并根据匹配长度进行打分。得分最高的种或属将是reads的分类结果。reads可以被分给多个物种，Centrifuge使用EM算法来量化已识别物种的丰度。由于微生物组参考数据库的规模不断扩大，Centrifuge使用同属物种之间的高序列相似性，可以压缩参考数据库。

# 使用RNA-seq进行微生物分类
centrifuge \
  -x ref_files/centrifuge_index/p_compressed+h+v \ #参考索引下载：https://ccb.jhu.edu/software/centrifuge/manual.shtml#nt-database
  -p 16 \
  --host-taxids 9606 \
  -1 ${sample}_1.fastq.gz \
  -2 ${sample}_2.fastq.gz \
  -s ${sample}_classification.txt.gz \
  --report-file ${sample}_report.txt

结果输出：

• name：微生物名
• taxID：物种ID
• taxRank：分类单位
• genomeSize：
• numReads：
• numUniqueReads：
• abundance：

参考

Yang Liu, Jennifer Altreuter, Yang Lin. Tutorial of RNA-seq tumor immunity analysis
RNA-seq免疫分析流程RIMA的教程